探针标记标记物与一方法

一、探针核酸探针标记物种类及其特点

探针标记的标记目的是为了跟踪探针的去向，确定探针是物标否与相应的基因组DNA杂交，即显示出与核酸探针具有同源性序列的记方精确位置，从而判断阳性菌落的探针位置、靶核酸在细胞中的标记位置(原位杂交)，或特异性片段的物标大小(转移印迹杂交)等。

一种理想的记方探针标记物，应具备以下几种特性：①高度灵敏性；②标记物与核酸探针分子的探针结合，应绝对不能影响其碱基配对特异性；③应不影响探针分子的标记主要理化特性，特别是物标杂交特异性和杂交稳定性，杂交体的记方解链温度(t_m)应无较大的改变；④当用酶促方法进行标记时，应对酶促活力(K_m)无较大的探针影响，以保证标记反应的标记效率和标记产物的比活性，当标记探针还继续作为下一步酶促反应的物标底物(如用于DNA序列测定)时，应不能影响此步骤的酶活性；⑤检测方法除要求高度灵敏性外，还应具有高度特异性，尽量减低假阳性率。如果要求更严一些，它还应具有较高的化学稳定性，保存时间较长，标记及检测方法简单，对环境无污染，对人体无损伤，价格低廉等。常用的探针标记物有两类：放射性核素和非放射性核素标记物。

(一)放射性核素

放射性核素是目前应用较多的一类探针标记物，包括³²P、³H和³⁵S等，主要优点：①放射性核素的灵敏度极高，可以检测到10¹⁸一10^-14g的物质，在最适条件下，可以测出样品中少于1000个分子的核酸含量；②放射性核素与相应的元素具有完全相同的化学性质，因此对各种酶促反应无任何影响，也不会影响碱基配对的特异性、稳定性和杂交性质；③放射性核素的检测具有极高的特异性，少数假阳性结果的出现，极少是由于放射性核素引起的，而主要是由杂交过程本身导致的。按严格规程操作(主要是预杂交和洗膜)则假阳性率极低。

其主要缺点：①易造成放射性污染；②当标记活性极高时，放射线可以造成核酸分子结构的破坏；③多数放射性核素的半衰期都较短，因此必须随用随标，标记后立即使用，不能长期存放(³H与¹⁴C除外)。常用作探针标记物放射性核素有：

(1)³²P。³²P放射性强，其所释放的β一粒子能量高，穿透力较强，因此放射自显影所需时间短，灵敏度高，被广泛应用于各种滤膜杂交以及液相杂交中，特别适合于基因组中单拷贝基因的检测。其缺点是半衰期短；射线散射严重，导致X线片上带型轮廓不清，有时会影响到结果的分析，特别是当要求高分辨率时(如DNA序列测定和细胞原位杂交)。³²P大多是以标记的各种核苷酸(³²P—NTP)和脱氧核糖核苷酸(³²P—dNTP)的形式提供的。

(2)³⁵S,³⁵S原子可以取代磷酸分子上的一个氧原子，从而形成筘s标记的核苷酸分子。核苷酸分子结构上的这种改变，对于大多数核酸修饰酶(如DNA和RNA聚合酶、激酶和磷酸酶等)的活性没有太大的影响，是其适宜的反应底物，可以直接替代。³²P标记的核苷酸用于探针标记。也有报道表明，这种结构上的改变会抑制DNA聚合酶的活性，使其掺入速率下降。

(3)³H,³H释放的届粒子能量极低，散射极少，因此在感光乳剂上的成影分辨率最高，本底较低，最适用于细胞原位杂交，但放射自显影所需时间较长。目前也有较多的人用³²P和³⁵S代替³H进行原位杂交。³H的另一优点是半衰期长，标记的探针可存放较长时间。

(4)¹²⁵I和¹³¹I碘放射性同位素在20世纪70年代曾被广泛用于核酸探针的标记，现已极少被采用，但碘放射性同位素仍然有其特有的优点：①可以用化学方法直接进行标记，操作简单，特别适合于RNA探针的标记；②放射线的散射作用较弱，分辨率较高，与³H差不多，而曝光时间则短得多，比较适合于细胞原位杂交；③来源方便，价格低廉。比较而言，¹²⁵I较¹³¹I好，因为¹²⁵I的半衰期较长、射线的能量较低。碘同位素最大的缺点是具有挥发性，虽然碘同位素一般是以不具有挥发性的碘化钠形式提供的，但在反应过程中还是有可能产生挥发性碘，被人吸收后蓄积在甲状腺中不易被排出，致使机体接受长期照射。

(二)非放射性标记物

非放射性指示系统是基于选用特异的互补探针相互作用来检测各种生物靶分子。适宜的检测系统是与这些探针配对的，直接通过共价结合，或间接地通过附加的特异高亲和力的相互作用。新近发展起来的非放射性系统大多数是基于报告基因的酶学、生物化学或化学的结合。这些基团能被具有高灵敏光学的、发光的、荧光的或金属沉淀的检测系统检测出来。

不同的非放射性系统可以分类为直接的和间接的两种类型，它们之间的差别在于检测反应的成分种类及其反应步骤的次数。直接系统大多是被用于检测标准化的靶生物分子，而间接系统常常被用于检测具有变异特性的不同靶生物分子。

用于直接系统的报告基团是直接地与探针结合，常使用的直接报告基团是荧光染料[如荧光素及碱性蕊香红(Rhodamine)]和标志酶如碱性磷酸酶(AP)，或辣根过氧化物酶(HRP)与化学发光检测结合。

在间接系统中，报告基团通过探针的修饰基团和被结合到修饰探针的特异指示剂分子之间非共价键的相互作用，间接地结合在一起。因此，间接系统首先要求用于特异分析的探针需预先导入特殊修饰基团。用作修饰基团的已知系统有维生素(如生物素)或各种半抗原，如地高辛、荧光素、二硝基苯基(DNP)、溴脱氧尿核苷或免疫金(Immunogold)。

在问接的非放射性系统中，最重要的系统是地高辛配基、生物素和荧光素系统。

1、地高辛配基系统

异羟基洋地黄毒苷配基，简称地高辛配基(Digoxigenin，DIG)，是一种类固醇半抗原，自然界存在于洋地黄植物。dUTP是通过问臂连接类固醇半抗原地高辛配基(DIG—Dutp)。杂交反应后，杂交的靶DNA通过酶联免疫法与一个抗体复合物[抗地高辛配基碱性磷酸酶复合物(AIG-AP)]结合，接着在5-溴-4-氯-3-吲哚酸盐(X-磷酸盐)和硝基蓝四唑盐(NBT)存在下，由酶催化生成颜色反应。

2、生物素系统

在生物素(Biotin)系统中，结合的成分被加入的维生素生物素所修饰，而结合的生物素可用与它相黏合的指示剂蛋白，即抗生物素蛋白(Avidin)或链抗生物素蛋白(Streptavidin)进行测定，抗生物素蛋白来自鸡蛋蛋白，链抗生物素蛋白分离自链酶菌属抗生物素蛋白。每种蛋白质有四个与生物素高亲和力的结合位点，结合常数为K=10¹⁵／mol。标记的生物素已广泛地被用于多种不同的检测，包括核酸、蛋白质和聚糖印迹在溶液或原位中的检测，其检测类型包括直接或间接两种形式。

3、荧光素系统

荧光系(Ieuorescein)是另一种基础抗体系统，在此系统中荧光素标签(Fquoresceintag)被用作修饰基团，以其高亲和力抗体与标志酶(如碱性磷酸酶A)相结合。检测核苷酸的灵敏度可达皮克(pg)以下。如同DIG系统一样，特殊的荧光素抗体的特异性是高的。荧光素修饰对光是敏感的，因此应用这种修饰基团标记的试剂应注意避免光照。联合使用DIG生物素和荧光素标记的探针，可以达到同时对三种不同特异序列的多颜色检测。

4、二硝基苯基系统

二硝基苯基(Dinitrophenyl，DNP)指示剂系统的建立，主要是为了用DNP作为修饰基团的原位方法和特异的DNP鼠单克隆IgG抗体，最终的荧光信号或酶的信号，被用合适的抗鼠IgG结合而产生。

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